激(ji)光共聚焦顯(xian)微鏡可以觀(guan)(guan)察到細胞內已經標記好的蛋白質和(he)分(fen)子，為(wei)生物學研(yan)究(jiu)提供(gong)了更直觀(guan)(guan)的觀(guan)(guan)測方(fang)法。如今，激(ji)光共聚焦成(cheng)像已經是一個(ge)非(fei)常常規的實驗(yan)操作(zuo)，廣泛應用于生物學各個(ge)研(yan)究(jiu)領域中。
在細胞實驗中，如果要(yao)進行一次激光共聚(ju)焦成像，除(chu)了要(yao)知道相關的(de)顯微(wei)鏡參數(shu)設(she)置和(he)操作以外，樣品(pin)的(de)準備(bei)也是非常重要(yao)的(de)一個環節。
由于激光(guang)共聚焦實(shi)驗(yan)對觀測(ce)耗材的(de)(de)底部有著比較(jiao)高的(de)(de)要求(qiu)，普通(tong)的(de)(de)培(pei)養皿，培(pei)養板(ban)或者(zhe)培(pei)養瓶都不能直接用于激光(guang)共聚焦成像。
1.比較常用(yong)的(de)(de)是使用(yong)170μm左右厚(hou)度的(de)(de)蓋(gai)(gai)玻片作為激光共(gong)聚焦成像的(de)(de)細胞載體。但是使用(yong)蓋(gai)(gai)玻片，在(zai)實驗(yan)操(cao)作上是非常麻煩的(de)(de)，如果買的(de)(de)是國產的(de)(de)蓋(gai)(gai)玻片，首先要做的(de)(de)一步是將蓋(gai)(gai)玻片清洗并且烘干滅(mie)菌(jun)，才(cai)能開始使用(yong)。
2.進口的細胞爬(pa)(pa)片，雖然不需要清洗(xi)，但是還是需要進行包被才(cai)能(neng)讓(rang)細胞正常貼壁生長。通常是將處(chu)理(li)好爬(pa)(pa)片直接放(fang)在(zai)多(duo)孔板中(zhong)，然后鋪(pu)細胞，熒光染(ran)色后，再(zai)(zai)用鑷子將爬(pa)(pa)片拿出，反(fan)過(guo)來放(fang)在(zai)滴有封片劑（甘(gan)油(you)配置）的載玻片上，再(zai)(zai)進行成像。如圖(tu)1所示：
圖1：使用蓋玻片和細胞爬片的做免疫熒光方法示意(yi)圖
操作流程：
1.蓋玻片需用(yong)濃硫(liu)酸浸泡過夜，第二(er)天用(yong)自(zi)來(lai)水沖洗20遍，置(zhi)于無水乙醇中6小(xiao)時，后用(yong)三蒸(zheng)水沖洗3遍，再放在飯(fan)盒(he)或玻璃(li)培(pei)養皿中烘干(gan)，消毒(du)，再烘干(gan)后放入超凈臺(tai)備(bei)用(yong)。
2.準備好的蓋玻(bo)片(pian)或者專業的細胞爬片(pian)需要根據細胞的貼壁情(qing)況使(shi)用多聚賴氨酸(suan)等蛋白(bai)包被。
3.培養(yang)板中放置爬(pa)片(pian)非常有技巧，要將爬(pa)片(pian)與培養(yang)板底部緊密貼(tie)合，這樣才能避免(mian)長成雙層細(xi)胞。
4.常規免(mian)疫熒光操作后(hou)，取出爬片(pian)。準備載玻(bo)片(pian)一(yi)張，在中間(jian)滴(di)加(jia)適(shi)量的封(feng)(feng)片(pian)劑（甘油配(pei)置），將蓋玻(bo)片(pian)或爬片(pian)翻過(guo)來(lai)，蓋在封(feng)(feng)片(pian)劑上，再用指(zhi)甲油封(feng)(feng)片(pian)進行(xing)成像。
5.在(zai)激(ji)光共(gong)(gong)聚(ju)焦成(cheng)像之前，盡量用(yong)熒光顯(xian)微(wei)鏡檢查一(yi)(yi)下細(xi)胞狀態(tai)和成(cheng)像效(xiao)果(guo)，再去做(zuo)激(ji)光共(gong)(gong)聚(ju)焦，畢竟(jing)做(zuo)一(yi)(yi)次激(ji)光共(gong)(gong)聚(ju)焦的(de)成(cheng)像也不便(bian)宜的(de)。
ibidi無需爬(pa)片(pian)的(de)簡(jian)便方法
這(zhe)里(li)要(yao)介紹ibidi的簡(jian)便方法，大(da)(da)大(da)(da)簡(jian)化了樣品準備流(liu)程，需(xu)要(yao)用到專為共聚焦(jiao)實驗設計的共聚焦(jiao)培養(yang)皿(min)，這(zhe)里(li)以(yi)(yi)德國(guo)ibidi的共聚焦(jiao)培養(yang)皿(min)為例（ibidi 81156，ibiTreat底部(bu)處理）進(jin)行說(shuo)明。共聚焦(jiao)培養(yang)皿(min)的底部(bu)是polymer聚合物材(cai)質，具有親水表面，讓大(da)(da)多(duo)數(shu)種(zhong)類的細胞(bao)都可(ke)以(yi)(yi)直(zhi)(zhi)接(jie)貼壁(bi)，無需(xu)另外進(jin)行包被；同(tong)時，它們的底部(bu)符合蓋玻片標(biao)準——厚度僅為180μm，在折射率，阿貝(bei)系數(shu)上(shang)，它們的性(xing)能和(he)標(biao)準爬片一致，再(zai)加上(shang)極(ji)低的自發熒光和(he)細胞(bao)可(ke)以(yi)(yi)直(zhi)(zhi)接(jie)貼壁(bi)的特性(xing)，使它們成為共聚焦(jiao)成像的專用培養(yang)皿(min)。
所有的(de)操作都(dou)在培養皿中進行，不再需要鑷子(zi)以及(ji)繁瑣的(de)清洗，滅菌，包(bao)被程序（流程如(ru)圖(tu)2所示）
圖2：共聚焦(jiao)專(zhuan)用(yong)培(pei)養皿的(de)準(zhun)備樣品流程，可(ke)以直(zhi)接(jie)進行細(xi)胞培(pei)養－染色－成像操(cao)作(zuo)（圖中使用(yong)的(de)產(chan)品為ibidi 81156共聚焦(jiao)培(pei)養皿）
操作流程：
1.在超凈臺中(zhong)打開(kai)無菌包(bao)裝(zhuang)的共聚焦專用培養(yang)(yang)皿(min)(min)，取出培養(yang)(yang)皿(min)(min)，加(jia)入(ru)細(xi)胞(bao)懸液，蓋(gai)上皿(min)(min)蓋(gai)，放入(ru)培養(yang)(yang)箱中(zhong)靜置，等待(dai)細(xi)胞(bao)貼(tie)壁(bi)。常(chang)規細(xi)胞(bao)培養(yang)(yang)，待(dai)細(xi)胞(bao)長置合(he)適密度再取出，進行免疫熒(ying)光染色。
2.吸(xi)出培(pei)養(yang)基，以PBS清(qing)洗細(xi)胞，再(zai)用2%的(de)多聚甲醛PBS溶液固定細(xi)胞。
3.20分鐘(zhong)后，吸(xi)出固定液，加入0.1%Triton X-100
4.10分鐘(zhong)后，吸出Triton，清洗細胞后加入BSA封閉。
5.加(jia)(jia)入抗體(ti)熒光染色后，吸出所有試(shi)劑(ji)，加(jia)(jia)入封片劑(ji)，可以開始共聚焦顯微成像。
使(shi)用共聚焦培養皿(min)還有個(ge)好處：往往一個(ge)共聚焦掃描成像持(chi)續時間很長，培養皿(min)中(zhong)的液體(ti)非(fei)常容易揮(hui)發(fa)，共聚焦培養皿(min)有皿(min)蓋，可以(yi)減少揮(hui)發(fa)；如上述提到的ibidi共聚焦培養皿(min)，有個(ge)巧(qiao)妙的鎖扣設計(ji)，可以(yi)扣緊(jin)培養皿(min)，確(que)保在共聚焦成像的過(guo)程中(zhong)，皿(min)中(zhong)的液體(ti)不會揮(hui)發(fa)(如圖3）。
圖(tu)3：ibidi共聚焦培(pei)養(yang)皿的鎖扣(kou)設計
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